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TRzol LS(液體樣本 RNA 提取試劑)公司正在出售的產(chǎn)品:新生隱球菌基因組DNAA431(A-431)人表皮癌細(xì)胞6磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH)測試盒(比色法)牙齦卟啉單胞菌基因組DNAA498人腎癌細(xì)胞肌酸激酶(CK)測試盒(比色法)熒光假單胞菌基因組DNAA549 人肺癌細(xì)胞 硫氧還蛋白氧化還原酶(TrxR)測試盒(比色法)詹氏乳酸桿菌基因組DNAA549+RF
更新時(shí)間:2024-01-12
商品屬性:
產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 貨號 |
TRzol LS(液體樣本 RNA 提取試劑) | 50ml×2 | A-Hc2003 |
儲(chǔ)存條件:
TRzol LS 在室溫下能穩(wěn)定保存 12 個(gè)月。盡管如此,為達(dá)到最佳效果,我們建議保存在 2-8°C 的環(huán)境下。
重要提示:
有毒物接觸皮膚或者不慎吞服,會(huì)導(dǎo)致灼傷。一旦接觸皮膚后立即以大量的洗滌劑和清水清洗。若感不適,看醫(yī)生并尋求和其他成分的正確治療方案。
產(chǎn)品介紹:
TRzol LS試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心,樣品分成水樣層、中間層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后,RNA可以通過異丙醇沉淀來回收。無論是人、動(dòng)物、植物還是細(xì)菌,該方法對少量及大量的組織和細(xì)胞均有較好的分離效果。TRzol LS 試劑操作上的簡單性允許同
時(shí)處理多個(gè)樣品。所有的操作可以在一小時(shí)內(nèi)完成。TRzol 抽提的總 RNA 能夠避免DNA 和蛋白的污染,可用于 RNA 印跡分析、斑點(diǎn)雜交、poly(A)+篩選、體外翻譯、RNA 酶保護(hù)分析和分子克隆。如果是用于 PCR,當(dāng)兩條引物位于單一外顯子內(nèi)時(shí),建議用擴(kuò)增級的DNase I 來處理抽提的總RNA。
注意事項(xiàng):
1.從少量的組織(1~10mg)或細(xì)胞(10 2-10 4 個(gè))中分離RNA 樣品:往組織或細(xì)胞中加 入 800µl TRzol。待樣品裂解后,加入氯仿并進(jìn)行步驟 2 中的抽提操作。在用異丙醇沉 淀 RNA 之前,加入 5~10μg 無 RNA 酶的glycogen 作為水樣層的載體。為降低其黏度 在加入氯仿前用 26 號注射器抽吸兩次以切斷基因組DNA。Glycogen 會(huì)留在水樣層中 并和 RNA 共析出。在濃縮到 4mg/ml 之前它不會(huì)抑制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)第一鏈的合成也不會(huì) 抑制 PCR。
2.在勻漿化后和加入氯仿之前,樣品可以在-60℃或者-70℃保存至少一個(gè)月。將 RNA 沉淀溶于 75%的乙醇在 2-8℃至少可以保存一周,在-5—-20℃下至少可保存一年。
3.用 TRzol LS 抽提 RNA 時(shí)要戴手套和護(hù)眼罩。避免接觸皮膚和衣服。在化學(xué)通 風(fēng)櫥完成操作。避免呼吸道吸入。如無例外,室溫保持在 15~30℃的條件下。
自備試劑:
氯仿 、 異丙醇、75%乙醇(RNase-Free water 配制)、RNase-Free water(將水加入 無 RNA 酶的玻璃瓶中,加入 DEPC 至 0.1% (V/V)。放置過夜并高壓滅菌)。0.5% SDS 溶液(RNase-Free water 配制)(可選)。
操作步驟:
1.樣品預(yù)處理 a.生物液體 每0.25ml液體樣品(血清,血漿等等)加入0.75ml TRzol LS,用加樣槍吹打液體樣品 幾次以幫助裂解樣品中細(xì)胞。每5~10×10 6個(gè)細(xì)胞至少加入0.75ml TRzol LS。對于含有高 污染物樣品如全血樣品,可以用滅菌水按照1:1比例稀釋一倍后開始提取。TRzol LS 和液體樣品的終體積比總是3:1。 b.組織 用glass或強(qiáng)力勻漿器攪勻組織樣品,每50~100mg組織或者0.25ml組織懸液加 0.75ml的TRzol LS。一般50~100mg組織體積都要小于0.25ml,如果組織樣品的體積小 于0.25ml,加入滅菌水將組織樣品體積調(diào)整到0.25ml以保證體積比例是3:1。 c.單層生長的細(xì)胞 直接往直徑3.5 cm的培養(yǎng)板中加入0.3ml-0.4ml的TRzol LS溶解細(xì)胞,用加樣槍吹打 幫助充分裂解細(xì)胞。依據(jù)培養(yǎng)板的面積而不是依據(jù)細(xì)胞的數(shù)量來決定所需的TRzol LS 量 (每10cm2加0.3-0.4ml)。不需要往裂解物里面加水,因?yàn)榕囵B(yǎng)板中附著殘留的培養(yǎng)液 已經(jīng)充分稀釋了TRzol LS 。 d.懸浮生長的細(xì)胞 通過離心來沉淀細(xì)胞。在TRzol LS試劑中用移液管反復(fù)吹打來裂解細(xì)胞。每 5~10×10 6的動(dòng)物細(xì)胞,植物或酵母菌細(xì)胞或每1×10 7細(xì)菌加0.75ml的TRzol LS。和步驟 b 一樣用滅菌水調(diào)節(jié)樣品體積到0.25ml。在加入TRzol LS前應(yīng)避免洗滌細(xì)胞,因?yàn)槟?樣會(huì)增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和細(xì)菌可能需要使用勻漿器。 2.分離階段 將勻漿樣品在15-30°C條件下孵育5min以使核蛋白體分解。每0.75ml TRzol LS 加0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋,用手用力搖晃試管15秒并將其在室溫下孵育2~15 min。 在2~8°C下以不超過12,000×g的離心力高速冷凍離心15 min。離心后混合物分成三層: 下層-氯仿層,中間層,上層無色的水樣層。RNA無一例外地存在于水樣層當(dāng)中。 水樣層的容量大約為所加TRzol LS 容量的70%。
2.RNA 的沉淀 將水樣層轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中,如果希望分離DNA和蛋白,有機(jī)層和中間層同 樣要予以保留。通過將水樣層和異丙醇混合來沉淀RNA。每0.75ml TRzol LS對應(yīng)0.5ml 異丙醇。將混合的樣品在15-30°C條件下孵育10min并在2~8°C下以不超過12,000×g的離 心力高速冷凍離心10 min。RNA沉淀在離心前通常不可見,離心后會(huì)形成一膠狀片狀 沉淀附著于試管壁和管底。
3.RNA 的漂洗 移去上層懸液。用75%的乙醇(RNase-Free water配制)洗滌RNA沉淀一次,每0.75ml 的TRzol LS至少加1ml的75%乙醇。旋渦振蕩混合樣品并在2~8°C下以不超過7,500×g的 離心力高速冷凍離心5 min。
4.RNA 的再溶解 室溫簡單干燥 RNA 沉淀,不要在真空管里離心干燥 RNA。尤為重要的是,不能讓 RNA 沉淀干燥那樣會(huì)極大地降低它的可溶性。部分溶解的 RNA 樣品其 OD260 /OD280 比值<1.6 。用移液管分幾次移取 RNase-Free water 或 0.5%SDS 溶液 (RNase-Free water 配制)來溶解RNA(如果RNA 以后要用于酶切反應(yīng)時(shí),避免使用SDS。) RNA 還能被 100%甲酰胺(除去離子)再溶解并保存在-70°C。
PCR基本步驟及注意事項(xiàng)?
一、實(shí)驗(yàn)原理
PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法,它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列,實(shí)現(xiàn)對特定位置的擴(kuò)增;PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境;反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣,DNA雙鏈打開,引物結(jié)合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復(fù)重復(fù)此過程即可實(shí)現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。
在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增,達(dá)到較高水平。因此,應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),在平臺期前結(jié)束反應(yīng), 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。
二、主要的成分
1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠,質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。
注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增,原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。
2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,提取的濃度也往往比較大,為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。
PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問題有哪些?
沒有ct值
檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:
1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));
2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號,另外熒光采集是否選中;
3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;
4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;
5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。
ct值過晚
在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。
因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。
1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);
2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長10s);
3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;
4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過500bp;
5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測或?qū)⒛0暹M(jìn)行稀釋。
公司正在出售的產(chǎn)品:
沃氏葡萄球菌基因組DNA | 5637人膀胱癌細(xì)胞 | 輔酶ⅠNAD(H)含量測試盒(比色法) |
無乳鏈球菌基因組DNA | 8305C人甲狀腺癌細(xì)胞8305C(未分化) | NAD激酶(NADK)測試盒(比色法) |
人葡萄球菌基因組DNA | 143B 人骨肉瘤細(xì)胞 | 乳酸脫氫酶(LDH)測試盒(比色法) |
鮑曼不動(dòng)桿菌基因組DNA | 22RV1人前列腺癌細(xì)胞 | NAD蘋果酸脫氫酶(NADMDH)測試盒(比色法) |
鮑氏志賀氏菌基因組DNA | 293FT人胚腎細(xì)胞 | NADP蘋果酸脫氫酶(NADPMDH)測試盒(比色法) |
頭葡萄球菌基因組DNA | 293T人胚腎細(xì)胞 | 線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ/NADH輔酶Q還原酶測試盒(比色法) |
近平滑假絲酵母基因組DNA | 5-8F人高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞系 | NADH氧化酶(NOX)測試盒(比色法) |
單核增生李斯特菌基因組DNA | 769-P人腎細(xì)胞腺癌細(xì)胞 | 檸檬酸合酶(CS)測試盒(比色法) |
需血斯尼思氏菌基因組DNA | 786-O[786-0]人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞 | 乙醇含量測試盒(比色法) |
雙路普雷沃氏菌基因組DNA | 95-D人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞 | 乙醇脫氫酶(ADH)測試盒(比色法) |
陰道范妮黑塞氏菌基因組DNA | A172人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 | 甲醛脫氫酶(FDH)測試盒(比色法) |
副流感嗜血桿菌基因組DNA | A-204人橫紋肌肉瘤細(xì)胞 | 乙醛脫氫酶(ALDH)測試盒(比色法) |
格氏李斯特氏菌基因組DNA | A2058人黑色素瘤細(xì)胞 | 輔酶ⅡNADP(H)含量測試盒(比色法) |
陰道加德納氏菌基因組DNA | A2780人卵巢癌細(xì)胞 | NADP磷酸酶(NADPase)測試盒(比色法) |
巴西曲霉基因組DNA | A2780+GFP人卵巢癌細(xì)胞+GFP | 6磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)/葡萄糖6磷酸脫氫酶測試盒(比色法) |
光滑假絲酵母基因組DNA | A3人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞 | 胞漿異檸檬酸脫氫酶(ICDHc)測試盒(比色法) |
化膿性鏈球菌基因組DNA | A375人惡性黑色素瘤細(xì)胞 | NADP蘋果酸酶(NADPME)測試盒(比色法) |
百日咳鮑特菌基因組DNA | A375+EGFP人惡性黑色素瘤細(xì)胞+EGFP | NAD蘋果酸酶(NADME)測試盒(比色法) |
新生隱球菌基因組DNA | A431(A-431)人表皮癌細(xì)胞 | 6磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH)測試盒(比色法) |
牙齦卟啉單胞菌基因組DNA | A498人腎癌細(xì)胞 | 肌酸激酶(CK)測試盒(比色法) |
熒光假單胞菌基因組DNA | A549 人肺癌細(xì)胞 | 硫氧還蛋白氧化還原酶(TrxR)測試盒(比色法) |
詹氏乳酸桿菌基因組DNA | A549+RFP 人肺癌細(xì)胞+RFP | 還原酶(GR)測試盒(比色法) |
綠膿假單胞菌基因組DNA | A549+luc 人肺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 | 還原型(GSH)測試盒(比色法) |
加氏乳桿菌基因組DNA | A673人橫紋肌瘤細(xì)胞 | 氧化型(GSSG)含量測試盒(比色法) |
惰性乳桿菌基因組DNA | A875人黑色素瘤細(xì)胞 | TRzol LS(液體樣本 RNA 提取試劑)肽過氧化物酶(GPX)測試盒(比色法) |
卷曲乳桿菌基因組DNA | AAV-293人胚腎細(xì)胞 | 硫氧還蛋白過氧化物酶(TPX)測試盒(比色法) |
支氣管炎博德特氏菌基因組DNA | AC16人心肌細(xì)胞 | S轉(zhuǎn)移酶(GST)測試盒(比色法) |